Ключевые слова: гетерогенные биокатализаторы, МУНТ, адсорбция, рекомбинантная липаза, этерификация, сложные эфиры жирных кислот, моноэфиры диолов.

Биокатализ (БК) как самостоятельное научно-практическое направление биотехнологии сформировался более полувека тому назад, и в самом начале своего становления назывался «инженерная (или прикладная) энзимология». Исследования были полностью направлены в сторону решения сугубо практических задач целенаправленного превращения исходного реагента (субстрата) в востребованный рынком продукт с помощью одной (реже – нескольких) ферментативных реакций. Основной задачей, решаемой специалистами в области биокатализа, являлась разработка технологии производства целевого продукта в целом, включая разработку и приготовление активного и стабильного биокатализатора (БК), а также дизайн высокопроизводительных специально сконструированных реакторов, в том числе вихревых. Учитывая междисциплинарный характер данного направления, специалистам требовались разносторонние знания, профессиональные навыки и компетенции из различных областей, таких, как энзимология, микробиология и генная инженерия, ферментативный катализ, а также кинетика, макрокинетика (диффузионная), химическая технология и инженерные дисциплины. В последнее время в связи с развитием молекулярной биологии и генетической инженерии встал вопрос: «Как сконструировать генно-инженерный (рекомбинантный) штамм, продуцирующий целевой фермент с заданными и/или регулируемыми каталитическими свойствами в больших количествах (супер-продуцент) и, важно, внеклеточно, что значительно упрощает процесс выделения и очистки?» В настоящее время ответ на данный вопрос получен, соответствующие протоколы генно-инженерных манипуляций составлены и апробованы, и так называемые рекомбинантные ферменты стали вполне доступными реагентами. Стоимость таких ферментов и, как результат, стоимость приготовленных биокатализаторов существенно снизились, что в конечном итоге привело к падению рыночной цены конечного продукта. В 2022 г. производство биокатализаторов составляло 25 % от общих расходов на суммарное мировое производство всех катализаторов [1]. Основным производителем и продавцом коммерческих биокатализаторов является компания NOVO (Novozymes, novozymes.com). Авторы обзора [1] уверены, что в ближайшие 10 лет применение ферментов в мировой экономике, медицине, экологии будет интенсивно расширяться. С точки зрения химика наиболее интересным направлением в биокатализе является разработка альтернативных процессов получения востребованных на рынке продуктов органического синтеза с помощью ферментов как уникальных катализаторов биологической природы.

Внедрение гетерогенного биокатализа в практику промышленного производства началось в 1970–80 гг. В настоящее время эффективно работают 10 крупнотоннажных процессов с участием гетерогенных биокатализаторов (табл. 1), более 130 коммерческих биокаталитических процессов описаны в монографиях [2–9]. Несомненно, основой для успешного внедрения биокаталитического процесса в промышленность является активный и стабильный гетерогенный биокатализатор, приготовленный путем иммобилизации ферментативно-активных субстанций (ФАС) на/в доступных носителях/матрицах. В качестве ФАС используют не только выделенные индивидуальные ферменты, но и целые, частично или полностью разрушенные микроорганизмы-продуценты [9]. Носители неорганической природы, такие как природные минералы (глины, цеолиты), оксиды металлов и материалы на основе диоксида кремния (силикагели, аэросилы), а также современные наноструктурированные углеродные материалы, полученные на основе нанотрубок, нановолокон, наносфер, рассматриваются как перспективные для приготовления коммерчески привлекательных БК благодаря их химической инертности, высокой устойчивости в реакционных средах, широкой доступности и относительно низкой стоимости. Механическая прочность и гидродинамические параметры неорганических носителей обеспечивают эффективную работу реакторов различного типа: проточных вытеснения (с неподвижным или псевдоожиженным слоем), периодических смешения, вихревых реакторов.

Следует отметить еще раз, что биокаталитические процессы промышленного масштаба, описанные в табл. 1, проводят в гетерогенном варианте, т.е., с участием твердофазных (гетерогенных) биокатализаторов. Согласно всем приведенным в литературе экономическим оценкам, гетерогенные процессы, проводимые в реакторах периодического и непрерывного действия, являются наиболее экономически выгодными по стоимости конечного продукта по сравнению с гомогенными технологиями. Так, компания TANABE SEYAKU (Япония, 1973 г.) сравнила затраты на производство ценного продукта – L-аспарагиновой кислоты, в гомогенном и гетерогенном вариантах. Расчеты показали, что за счет многократного использования иммобилизованных ферментов и существенного повышения их стабильности стоимость биокатализатора уменьшилась в ~9 раз, а затраты всего процесса, включающего стадию отделения готового продукта от БК и его очистки, – в 1,4 раза [2]. С тех пор расчеты экономической эффективности гетерогенных биокаталитических процессов по сравнению с их гомогенными вариантами изменились только в более выгодную сторону, поскольку для приготовления БК, как отмечалось выше, используют более дешевые и доступные рекомбинантные (генно-инженерные) ферменты. Кроме того, в настоящее время исследуют и апробируют дополнительные подходы, называемые «ферментной инженерией» или «инженерией биокатализаторов», заключающиеся в модуляции (изменении, управлении, контроле) каталитических свойств иммобилизованных ферментов путем выбора оптимального носителя-адсорбента. По мнению авторов обзора [10], «ферментная инженерия» полностью совместима с другими химическими и/или биологическими методами улучшения функциональных свойств ферментов. Успех данной «инженерной» работы определяется не только успехами генной инженерии, но достижениями химиков-материаловедов, разрабатывающих разнообразные современные функциональные материалы, перспективные для иммобилизации ФАС. Действительно, управление функциональными свойствами ферментов с помощью «ферментной инженерии» является интересным перспективным направлением в развитии гетерогенного биокатализа. Авторы глубокого и всеобъемлющего обзора [11] поставили вопрос: «Является ли иммобилизация ферментов зрелой дисциплиной?» и дали на него следующий ответ: «Хотя многие исследователи считают иммобилизацию ферментов зрелой дисциплиной, в которой почти все уже сделано (начиная с 1960-х), мы скорее считаем, что требуются еще более глубокие исследования для составления оптимальных протоколов иммобилизации, а также для объяснения нежелательных воздействий на фермент в процессе иммобилизации с целью исключения их негативного влияния на свойства приготовленного БК». По мнению авторов [11], «можно считать, что мы еще далеки от границ этих исследований, и будущее может принести много новых и замечательных достижений». Как и более полувека тому назад, разработка коммерчески привлекательного, активного и стабильного биокатализатора до сих пор является актуальной и непростой задачей, в котором все компоненты – природа фермента и носителя, способ иммобилизации, условия реакции и процесса в целом – играют одинаково важную роль.

Требования, предъявляемые к промышленным гетерогенным биокатализаторам, формулируются прежде всего в зависимости от востребованности и стоимости конечного продукта на рынке. Очевидно, промышленный БК должен обладать сравнительно высокой ферментативной активностью, обеспечивающей конверсию субстрата, близкую к 50 %, за десятки минут. Допустимым считается то, что наблюдаемая при иммобилизации потеря активности, обусловленная инактивацией фермента при непосредственном взаимодействии с поверхностью носителя, составляет ~25 % от активности растворимого фермента; «скрытая» активность из-за наличия диффузионных ограничений – ~20 %. Однако в редких случаях наблюдается гиперактивация иммобилизованного фермента, т.е. доля сохранившейся при иммобилизации активности превышает 100 %, что особенно характерно для липаз, иммобилизованных на гидрофобных носителях [12]. Промышленный БК должен обладать высокой операционной стабильностью в условиях его функционирования, а также повышенной термостабильностью, позволяющей провести процесс с высокими скоростями в относительно стерильных условиях (выше 50 ^оС). Стабильность, характеризующаяся временем полу-инактивации (t_½), равным 120 сут, позволяет проводить непрерывный процесс конверсии субстрата без перезагрузки реактора в течение 1 года [2]. Важным параметром является стоимость гетерогенного биокатализатора, включая стоимость фермента как активного компонента, носителя и метода иммобилизации. Вклад в стоимость конечного продукта не должен превышать 10 % (лучше 1 %). Очевидно, что требования к стоимости БК, осуществляющего синтез дорогостоящих хиральных производных для фармацевтической промышленности, отличаются от требований, предъявляемых к биокатализатору для многотоннажного производства глюкозо-фруктозных сиропов в пищевой промышленности. Важнейшей характеристикой любого коммерческого катализатора является его продуктивность, которая оценивается в тоннах произведенного продукта на 1 кг катализатора за время его функционирования. Продуктивность биокатализатора (в отличие от катализатора химической природы) оценивается как произведение активности БК при t_½ на два времени полу-инактивации (t_½), А∙2t_½, т.е. эксплуатацию БК заканчивают при потере 75 % первоначальной активности (а не 50 %, как в химическом катализе). Промышленные биокатализаторы, например для производства глюкозо-фруктозных сиропов, имеют суммарную продуктивность, равную не менее 4 т /1 кг БК.

В данной статье авторы описали результаты своих научно-практических исследований по разработке и приготовлению гетерогенных биокатализаторов для процессов низкотемпературного ферментативного синтеза разнообразных сложных эфиров (СЭ) различного назначения. Это сложные эфиры насыщенных монокарбоновых (жирных) С₄–С₁₈ кислот и алифатических С₂–С₁₆, а также моноэфиры С₂–С₆ диолов. В работе достаточно подробно описаны свойства БК, активным компонентом которых является «авторская» рекомбинантная липаза, сконструированная методами генетической инженерии (рук. Беклемишев А.Б.). Обратим внимание на наиболее существенные различия, указывающие на очевидные преимущества биокатализа перед традиционным органическим синтезом сложных эфиров (табл. 2): 1) более широкая специфичность относительно субстрата–спирта; 2) синтез эфиров углеводов, синтез которых традиционными химическими методами невозможен; 3) более простое аппаратурное оформление процесса синтеза; 4) наличие регио- и стереоспецифичности реакций синтеза/гидролиза. По мнению авторов, приготовленные ими биокатализаторы и биокаталитические процессы являются вполне достойной альтернативой химическому органическому синтезу.

Результаты и обсуждение

Биокаталитическая переэтерификация растительного масла с этилацетатом в этиловые эфиры жирных кислот

Смесь метиловых (реже – этиловых) эфиров жирных кислот, входящих с состав растительных масел, в настоящее время называют биодизелем. В Европе в качестве горючего в большинстве случаев используют смеси биодизеля с традиционным углеводородным дизельным топливом. Наиболее распространенной маркой является топливо В20 следующего состава: биодизель – 20 %, дизель – 80 %, т.е., цифры после буквы В обозначают процентное содержание биодизеля. При использовании горючего В5–В20 не требуется технических изменений в двигателях внутреннего сгорания, поскольку данные смеси имеют очень близкие к дизельному топливу физико-химические показатели (вязкость, теплотворность). В России систематические исследования по разработке коммерческих биокатализаторов процесса получения биодизеля из растительных масел не проводились, так как считалось, что производство биодизеля в качестве добавки к традиционному дизелю в российском регионе нерентабельно, в том числе из-за низкой урожайности технических масличных сельскохозяйственных культур (рапса).

В обзоре [13], посвященном современному состоянию и перспективам производства биодизеля, описаны современные технологии переэтерификации триглицеридов масел с участием катализаторов различной природы, в том числе ферментов – липаз. Пристальное внимание уделено гетерогенным катализаторам химической природы, а именно, кислотно-основным катализаторам на основе нанесенных оксидов металлов, таких как CaO/SiO₂, Fe₂O₃/CaO, Fe₂O₃/KOH, KF/CaO-Fe₃O₄. Максимальная, практически полная конверсия триглицеридов (99 %) была получена при метанолизе рапсового и соевого масел на катализаторах Na/Al-SBA-15 за 6 ч при 65 ^оС [13]. В обзорах [14, 15] более подробно описаны биокатализаторы на основе иммобилизованных микробиальных липаз, включая коммерческие БК компании NOVO (novozymes.com). Интересные аналитически оценки вклада цены биокатализатора (липазы) в стоимость произведенного биодизеля (в $/кг) проведены в работе [16]. В описанных авторами условиях, при использовании коммерческих БК типа Lypozyme^® и Novozym^® величина этого вклада зависела от типа сырья – рафинированные или отработанные растительные/фритюрные масла и составляла от 0,2 до 3 $/кг, тогда как при участии разработанного цельноклеточного биокатализатора вклад снижался на порядок (до 0,05 $/кг), независимо от качества исходного сырья [16].

Авторы данной статьи (Коваленко с сотр.) исследовали периодические и непрерывные процессы получения этиловых эфиров жирных кислот в реакции переэтерификации триглицеридов растительных масел с участием менее токсичных, чем метанол, ацил-доноров, таких как, метил- или этил-ацетат. В результате получали этиловые эфиры жирных кислот (биодизель) из подсолнечного масла и более ценный продукт – витамин F (из льняного масла) [17]. В оптимально подобранных условиях переэтерификации (40 ^оС, времени контакта 3,5 ч в реакторе с неподвижным слоем, мольном соотношении масла и этилацетата, равном 1 : (15÷20)) максимальная конверсия триглицеридов в этиловые эфиры жирных кислот – пальмитиновой, стеариновой, олеиновой и линолевой кислот – составила 60 % [17]. Время полу-инактивации приготовленных БК в условиях периодического процесса составило 720 ч [17]. Биокатализатор оптимального состава, способ его приготовления и способ переэтерификации растительных масел с использованием этого биокатализатора был защищен патентом РФ [18].

Биокаталитическая этерификация жирных кислот алифатическими спиртами

Синтез сложных эфиров органических карбоновых кислот, в том числе жирных, протекает путем этерификации спиртами в неводных средах с использованием или без органических растворителей. Короткоцепочечные сложные эфиры применяют в качестве душистых веществ, отдушек, длинно-цепочечные – в качестве смягчающих и поверхностно-активных компонентов, востребованных парфюмерной и косметической промышленностями [19–22]. Следует отметить, что рынок душистых веществ и ароматизаторов, оцененный в 2019 г. в $28 млрд., имеет устойчивую тенденцию к росту. Ожидается, что с 2021 по 2027 гг. совокупный годовой темп роста составит 4,7 %, до $35 млрд, (Flavors and Fragrance Market Size, Share & Trends|Forecast by 2027. https://www.alliedmarketresearch.com/flavors-and-fragrances-market (accessed on Dec 11, 2021). В современных обзорах и работах [23–25] описаны ферментативные синтезы эфиров углеводов (глюкозы, фруктозы, мальтозы), аскорбиновой кислоты (в качестве субстрата-спирта), фитостирола, с насыщенными и ненасыщенными жирными С₁₂–С₁₈ кислотами. Эфиры жирных С₁₂–С₁₆ кислот с углеводами (глюкозой, фруктозой, маннозой, арабинозой) используют как подсластители и неионные, биодеградируемые, нетоксичные сурфактанты в пищевой и косметической промышленностях, кроме того, данные эфиры обладают выраженным противомикробным действием, что позволяет использовать их в медицине. Процессы проводят с помощью иммобилизованными липаз, в том числе в составе коммерческих биокатализаторов Novozyme^® и Lipozyme^® (novozymes.com), приготовленных на основе рекомбинантных липаз, иммобилизованных на макропористом акриловом полимере и мелкодисперсном силикагеле соответственно.

Моноэфиры жирных кислот с многоатомными спиртами, в том числе этилен- и пропилен- гликолями, используют как поверхностно-активные вещества и присадки к моторным маслам, поскольку данные соединения обладают высокими чистящими, моющими, эмульгирующими, диспергирующими и стабилизирующими свойствами. Добавление к нефтяной основе технически обоснованного количества сложного эфира приводит к существенному улучшению его эксплуатационных параметров, таких как повышение смазочных и вязкостно-температурных характеристик и снижение температуры застывания [26, 27]. Высокое качество сложноэфирных смазочных материалов служит основой для разработки базовых авиационных и редукторных масел, а также универсальных и всесезонных (в том числе арктических) моторных масел. В маслах 1-го поколения использовали метиловые эфиры алифатических двухосновных кислот. Наиболее широкое применение нашел диоктил себацинат (ДОС) – диизооктиловый эфир себациновой (декандиовой, НООС–(СН₂)₈–СООН) кислоты [26]. Масло, приготовленное на основе высокоочищенной нефтяной базовой жидкости и ДОС, работало при температурах от –50 ^оС до +50 ^оС. В маслах 2-го поколения, разработанных для самолетов с газотурбинным двигателем, летающих с двукратным превышением скорости звука, в качестве основы используют сложные моноэфиры полиолов – неопентана (2,2-диметилпропан, С(СН₃)₄), триметилолэтана, триметилолпропана, пентаэритрита (2,2-бис(гидроксиметил) пропан-1,3-диола, C(CH₂OH)₄). Масла 2-го поколения превосходят масла 1-го поколения по смазочным характеристикам, летучести, термостабильности и работоспособности в интервале температур от –60 °C до +200 °C [26, 27]. Продукты реакции этерификации монокарбоновых кислот алифатического ряда, например С₅–С₉ кислот, получаемых окислением нефтяных парафинов, и пентаэритрита, являются ценными востребованными соединениями.

Авторы данной статьи (Коваленко с сотр.) в течение последних 13 лет проводят научно-практические исследования по приготовлению гетерогенных биокатализаторов, обладающих ферментативной активностью липазы, и изучают их каталитические свойства в реакции этерификации насыщенных монокарбоновых С₄–С₁₈ кислот первичными алифатическими С₂–С₁₆ спиртами, а также С₄-С₆ диолами. Как отмечалось выше, специалисты по генетической инженерии и молекулярной биологии (рук. д.б.н. Беклемишев А.Б.) сконструировали два генно-инженерных штамма-продуцента термофильной липазы из микроорганизма Thermomyces lanuginosus, один из которых rPichia/lip синтезировал целевой фермент внеклеточно и количественно секретировал его в ростовую среду, откуда липаза легко выделялась и частично очищалась. Путем адсорбционной иммобилизации рекомбинантной липазы на неорганических носителях были приготовлены и изучены три биокатализатора с рабочими названиями ЛипоСил, ЛипоКарб, ЛипоСИБ (табл. 3), которые, по мнению авторов, могут быть коммерчески привлекательными для процессов низкотемпературного синтеза различных сложных эфиров. Биокатализатор ЛипоСил был приготовлен пропиткой по влагоемкости коммерческого мезопористого силикагеля водными растворами липазы, с последующей сушкой в условиях окружающей среды. Биокатализатор ЛипоКарб был приготовлен путем физической адсорбции липазы на макропористом углеродном аэрогеле, образованным хаотическим переплетением углеродных нанотрубок (МУНТ) (рис. 1а). Биокатализатор ЛипоСИБ был приготовлен аналогично ЛипоКарбу, только в качестве адсорбента использовали коммерческий носитель Сибунит™, образованный наночастицами пироуглерода (рис. 1б), в том числе Сибунит™, модифицированный введением атомов азота с помощью оксида азота [28].

Известно, что липазы (гидролазы эфиров глицерина, КФ 3.1.1.3) обладают уникальным свойством проводить ферментативные реакции (синтез эфиров) в среде органических растворителей, абсолютно «чуждой» природе среде для их функционирования в живых организмах (гидролиз триглицеридов). Выбор оптимального состава неводной реакционной среды для синтеза эфиров липазами является далеко не простой научно-практической задачей, от решения которой зависят основные параметры процесса этерификации, такие как скорость реакции, состояние равновесия в системе «гидролизDсинтез», выход целевого продукта, а также стабильность БК. На примере реакции ферментативного синтеза бутил гептаноата (бутилового эфира энантовой С₇ кислоты) было обнаружено, что чистый гексан являлся оптимальной реакционной средой [31, 32]. В дальнейшем было показано, что оптимальный состав реакционной среды и условия проведения реакции этерификации определяются природой реагентов, прежде всего растворимостью субстратов и продукта в органических растворителях (табл. 4.). Этерификацию проводили в периодическом режиме в герметичных сосудах в течение 5–40 реакционных циклов, при этом продолжительность (в час, сут) каждого цикла определялась практически полной (≥85 %) конверсией органической кислоты в эфир. Для подготовки БК к следующему реакционному циклу использовали бинарные смеси растворителей гексана (Г) и диэтилового эфира (ДЭЭ), поскольку под действием данного бинарного растворителя десорбция продукта реакции (сложного эфира) с поверхности изученных носителей, как углеродной, так и силикатной природы, протекала наиболее полно.

Практически важным свойством приготовленных биокатализаторов являлась их субстратная специфичность; изменение этого свойства в зависимости от химической природы носителя-адсорбента была исследована наиболее подробно. Были составлены матрицы и/или диаграммы специфичности приготовленных БК для более 60 пар субстратов. Например, как видно на диаграмме рис. 2, адсорбированная липаза обладает широкой субстратной специфичностью: так, высокие скорости реакции наблюдались при этерификации С₇–С₁₀ кислот и С₄–С₁₆ спиртов.

В результате систематических достаточно масштабных исследований субстратной специфичности биокатализаторов типа ЛипоСил и ЛипоКарб были обнаружены как общие свойства приготовленных БК, так и различия, обусловленные химической природой носителей-адсорбентов. Как отмечалось выше, биокатализаторы обладали широкой субстратной специфичностью в реакции синтеза широкого набора сложных эфиров (СЭ) насыщенных монокарбоновых (жирных) С₄–С₁₈ кислот и первичных алифатических С₂–С₁₆ n-спиртов в очень мягких условиях (20 ± 2 ^oC, 1 бар). Сравнительный анализ также показал, что общими для двух типов БК являются следующие свойства: 1) максимальная по величине скорость реакции наблюдалась при синтезе бутил гептаноата – сложного эфира гептановой С₇ кислоты и бутилового С₄ спирта (n-, iso-), поэтому при составлении матриц и/или диаграмм специфичности данная скорость и соответствующая ей активность БК принималась за единицу, 1,0; 2) минимальной по величине была скорость синтеза этиловых (С₂) эфиров жирных; 3) интересно, что скорость синтеза сложных эфиров C₁₀ деканола была минимальной по величине и не зависела ни от химического строения молекулы субстрата-кислоты, ни от природы носителя-адсорбента – силикагель или углеродный аэрогель (на кривой зависимости скорости реакции от длины углеродной цепи спирта наблюдался выраженный глубокий минимум [34]); 4) изомеры С₄–С₅ кислот (iso-) этерифицировались со скоростями на 1–2 порядка ниже по сравнению с их линейными молекулами (n-), в то же время изомерия С₄–С₅ спиртов практически не влияла на скорость этерификации; 5) влияние на скорость этерификации строения молекулы субстрата, а именно, длины углеродного скелета кислоты, было заметнее и существеннее, по сравнению с длиной молекулы субстрата-спирта (рис. 2); 6) скорость реакции этерификации с участием вторичных спиртов была на порядок ниже по сравнению с первичными; третичные спирты в реакции этерификации не участвовали.

При анализе субстратной специфичности биокатализаторов ЛипоСил и ЛипоКарб были выявлены следующие различия. 1) В реакции синтеза этиловых С₂ эфиров монокарбоновых С₄–С₁₈ кислот относительная активность ЛипоСил была существенно ниже, чем у липазы в составе биокатализатора ЛипоКарб: например, для С₄–С₆ кислот – в 2,4–2,8 раза ниже, для С_7–18 кислот – в 1,2–1,6 раз ниже (рис. 3а). По-видимому, углеродный аэрогель, активно адсорбируя этиловый С₂ спирт на поверхности МУНТ, проявлял защитный эффект от известного инактивирующего (токсичного) действия этанола на жизненно важные ферменты, в том числе липазу; при этом в реакции синтеза бутиловых С₄ эфиров данный эффект не наблюдался (рис. 3б). 2) При синтезе высокомолекулярных СЭ высших С_7–18 кислот (например, С₉, С₁₀, С₁₈) и С₄–С₁₁ спиртов, наоборот, относительная активность ЛипоСил была в 1,5–2 раза выше по сравнению с ЛипоКарб (рис. 3б), что было весьма неожиданным результатом. Общеизвестно, что любой гетерогенный процесс, в том числе ферментативной этерификации, является многостадийным и включает как минимум стадии массопереноса субстратов из реакционной среды в пористое пространство носителя к адсорбированному на поверхности ферменту; реакцию синтеза эфира; массоперенос синтезированного продукта в реакционную среду. В результате изменение скорости этерификации является довольно непредсказуемым, и, как показали исследования, гидрофильный ЛипоСил оказался более эффективным биокатализатором синтеза гидрофобных высокомолекулярных СЭ по сравнению с гидрофобным ЛипоКарб, Следует подчеркнуть несомненное преимущество ЛипоСил и ЛипоСИБ по сравнению с ЛипоКарб, которое заключается в том, что носителем-адсорбентом для приготовления данных БК являются коммерческие мезопористые носители – силикагель КСК-Г^® и Сибунит™, доступные и относительно дешевые продукты многотоннажного химического производства.

Как отмечалось выше, моноэфиры жирных кислот и многоатомных спиртов, алифатических полиолов, обладают высокими чистящими, моющими, а также эмульгирующими, диспергирующими и стабилизирующими свойствами и используются как компонент синтетических смазочных масел. Авторы исследовали реакцию низкотемпературного синтеза моноэфиров диолов и гептановой кислоты в хлороформе [33]. Было показано, что скорость синтеза эфиров гептановой кислоты с короткоцепочечными С₂, С₃ диолами, содержащими как первичные, так и вторичные ОН-группы, является чрезвычайно низкой (близкой к нулю), и конверсия кислоты ≥50 % наблюдалась только через 7 сут. Было установлено, что С₂–С₄ диолы являлись необратимыми ингибиторами адсорбированной рекомбинантной липазы. Диолы, такие как 1,6-гександиол и разветвленный 2-этил-гексан-1,3 диол, этерифицировались со сравнительно высокими скоростями: так, максимальное значение активности составило 84 мкмоль/мин/г; конверсия С₇ кислоты в реакции этерификации 1,6-гександиолом – 94 % за 24 ч; доля моноэфира диола – 99 ± 1 % [33]. Было обнаружено, что при синтезе моноэфиров диолов важную роль играло расстояние между ОН-группами в их молекуле. Действительно, наблюдалась достоверная корреляция между данным расстоянием и активностью приготовленных БК: чем дальше друг от друга находились ОН-группы, тем выше была этерифицирующая активность биокатализаторов. Например, для этиленгликоля и его олигомеров (ди- и три-) наблюдалась линейная зависимость активности от расстояния между концевыми ОН-группами [33].

Наиболее важной с практической точки зрения характеристикой является операционная стабильность БК, именно эта характеристика вносит значительный вклад в оценку продуктивности биокатализатора (в тоннах продукта/кг БК). Приготовленные биокатализаторы ЛиплСил и ЛипоКарб обладали высокой стабильностью и сохраняли первоначальную ферментативную активность в течение нескольких десятков реакционных циклов (рис. 4). Одна из причин высокой стабильности заключалась в накоплении внутри биокатализатора образовавшейся при этерификации воды (продукта этой реакции), что создавало благоприятное водное микроокружение для иммобилизованной липазы. Основой причиной инактивации биокатализаторов в реакционных средах полярных органических растворителей (ацетон) была дегидратация БК. Поскольку этерифицирующая активность ЛипоСил и ЛипоКарб практически не изменялась в течение 30–40 реакционных циклов (500–1000 ч работы), то была оценена продуктивность биокатализаторов. В изученных условиях в зависимости от молекулярной массы СЭ продуктивность составила ⁓2–6 тонн синтезированного СЭ на 1 кг биокатализатора.

Как отмечалось выше, в хлороформе биокатализаторы полностью инактивировались в течение первых трех реакционных циклов. Для их реактивации было предложено периодически заменять реакционную среду, а именно, хлороформ на гексан. Так, после каждого реакционного цикла синтеза моноэфира диола, проведенного в хлороформе, проводили следующий реакционный цикл синтеза бутил гептаноата в гексане. Было обнаружено, что при замене реакционной среды активность биокатализаторов частично или полностью восстанавливалась и даже увеличивалась (в 1,1–1,3 раза) по сравнению с первоначальной активностью (рис. 5в) [33]. При использовании разветвленного диола, 2-этил-1,3 гександиола БК инактивировался медленнее по сравнению с линейным диолом, 1,6-гександиолом: так, за 20 реакционных циклов БК сохранил ⁓80 % и ⁓40 % первоначальной активности (рис. 5, а и в). При использовании триэтиленгликоля приготовленные биокатализаторы отличались высокой операционной стабильностью как в реакции синтеза моноэфиров, так и синтеза бутил гептаноата (рис. 5б). Таким образом, используя один и тот же биокатализатор ЛипоКарб, можно синтезировать ценные продуты органического синтеза, в том числе моноэфиры диолов и бутиловые эфиры гептановой кислоты, в течение продолжительного времени, используя практический прием смены реакционной среды и типа реакции.

Заключение

Авторы данной работы провели систематические исследования по разработке и приготовлению гетерогенных биокатализаторов (с рабочими назвваниями ЛипоКарб и ЛипоСил), изучению их физико-химических м каталитических свойств в реакциях низкотемпературного ферментативного синтеза ценных продуктов органического синтеза – сложных эфиров разнообразного назначения. Было установлено, что функциональные свойства приготовленных БК, такие как активность и субстратная специфичность, изменялись (модулировались) в зависимости от химической природы носителя. Так, активность и каталитическая константа для биокатализатора типа ЛипоКарб (липаза на углеродном аэрогеле) были в 20–30 раз выше, чем для ЛипоСил (липаза на силикагеле). Несмотря на широкую субстратную специфичность приготовленных биокатализаторов, синтез этиловых эфиров насыщенных монокарбоновых кислот протекал более эффективно с участием гидрофобного ЛипоКарба, тогда как синтез высокомолекулярных эфиров с выраженной гидрофобностью – с участием гидрофильного типа ЛипоСила

Исследования процессов низкотемпературного синтеза моноэфиров диолов с гептановой С₇ кислотой с участием биокатализатора ЛипоКарб показали, что содержание моноэфира составляет 98–99 %. Было показано, что скорость этерификации с участием симметричных диолов с концевыми первичными ОН-группами была максимальной и пропорционально коррелировала с расстоянием между концевыми ОН-группами. Были подобраны условия реактивации приготовленных биокатализаторов путем замены реакционной среды (хлороформ →гексан) и пары субстратов для этерификации.

По мнению авторов, приготовленные активные и высокостабильные биокатализаторы, обладающие активностью фермента липазы, обладают высоким коммерческим потенциалом для зеленых процессов низкотемпературного синтеза разнообразных сложных эфиров.

Литература

1. С.Д. Варфоломеев, В.К. Швядас, Е.Н. Ефременко и др. Успехи химии, 2024, 93 (12), RCR5144.

2. Березин И.В., Мартинек К. Введение в прикладную энзимологию. М.: Изд-во Моск. ун-та. 1982. 383 с.

3. Березин И.В. Исследования в области ферментативного катализа и инженерной энзимологии. М.: Наука. 1990. 382 с.

4. Биокатализ. (ред. Березин И.В., Кузнецов В.И.). М.: Наука. 1984. 344 с.

5. Hou C.H. Handbook of Industrial Biocatalysis. Tailor & Francis Group. 2005. 900 Р.

6. Grunwald P. Biocatalysis. Imperial College Press. 2009. 1035 P.

7. Buchholz K., Kasche V., Bornscheuer U.T. Biocatalysts and Enzyme Technology. Wiley-VCH. 2005. 431 P.

8. Tao J.; Kazlauskas R. Biocatalysis for Green Chemistry and Chemical Process Development. Wiley. 2011. 479 P.

9. Иммобилизованные клетки: биокатализаторы и процессы (ред. Ефременко Е.Н.). М.: РИОР. 2018. 500 С. (Коваленко Г.А., Перминова Л.В., Беклемишев А.Б. Иммобилизованные нерастущие микроорганизмы и их лизаты для одноферментных биокаталитических процессов. C. 57–92. Doi: 10.29039/02004-3.

10. Mateo C., Palomo J.M., Fernandez-Lorente G., Guisan J.M., Fernandez-Lafuente R. Improvement of enzyme activity, stability and selectivity via immobilization techniques // Enz. Microb. Technol. 2007. V. 40. P. 1451–1463.

11. Bolivar J. M., Woodley J. M., Fernandez-Lafuente R. Is enzyme immobilization a mature discipline? Some critical considerations to capitalize on the benefits of immobilization // Chem. Soc. Rev. 2022. V. 51. 6251 – DOI: 10.1039/d2cs00083k.

12. Rodrigues R. C., Virgen-Ortíz J. J., dos Santos J. C.S., Berenguer-Murcia Á., Alcantara.A. R., Barbosa O., Ortiz C., Fernandez-Lafuente R. Immobilization of lipases on hydrophobic supports: immobilization mechanism, advantages, problems, and solutions // Biotechnology Advances, 2019. V. 37. 746–770. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.04.003.

13. Salaheldeen M., Mariod A. A., Aroua M.K., Rahman S. M. A, Soudagar M. E. M., Fattah I. M. R. Current State and Perspectives on Transesterification of Triglycerides for Biodiesel Production // Catalysts. 2021. V. 11. C. 1121–1158. https://doi.org/10.3390/catal11091121.

14. Cavalcante T. F. T., Neto F. S., de Aguiar Falcao I. R., da Silva Souza J. E., de Moura Junior L.S., da Silva Sousa P., Rocha T. G., de Sousa I. G, de Lima Gomes P.H, de Souza M. C M., dos Santos J. C.S. Opportunities for improving biodiesel production via lipase catalysis // Fuel. 2021. V. 288. 119577. https://doi.org/10.1016/j.fuel.2020.119577.

15. Коваленко Г.А. Биокатализаторы и процессы ферментативной конверсии субстратов в ценные продукты химического органического синтеза (отечественные разработки) // Кинетика и катализ. 2023. Т. 64. № 5. С. 499–527.

16. Jin Z., Han S.-Y., Zhang L., Zheng S.-P., Wang Y., Lin Y. Combined utilization of lipase-displaying Pichia pastoris whole-cell biocatalysts to improve biodiesel production in co-solvent media // Bioresource Technology. 2013. V. 130. P. 102–109. http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2012.12.020.

17. Коваленко Г.А., Перминова Л.В., Беклемишев А.Б., Яковлева Е.Ю., Пыхтина М.Б. // Катализ в пром. 2014. № 6. С.71–79.

18. Патент РФ 2539101, опубл. в бюл. № 1 от 10.01.2015.

19. Войткевич С.А. 865 душистых веществ для парфюмерии и бытовой химии. М.: Пищевая промышленность, 1994. 594 с.

20. Солдатенков А.Т., Колядина Н.М., Ле Туань Ань Основы органической химии душистых веществ для прикладной эстетики и ароматерапии. М.: ИКЦ «Академкнига», 2006. 240 с.

21. Смирнов Е.В. Пищевые ароматизаторы (справочник). Санкт-Петербург: Профессия, 2008. 736 с.

22. Гамаюрова В.С., Зиновьева М.Е., Шнайдер К.Л., Давлетшина Г.А. Липазы в реакциях этерификации: обзор // Катализ в промышленности. 2020. Т. 20. № 3. С. 216–233.

23. Spallett A., Joly N., Martin P. Latest Trends in Lipase-Catalyzed Synthesis of Ester Carbohydrate Surfactants: From Key Parameters to Opportunities and Future Development // Int. J. Mol. Sci. 2024. 25. 3727–3754. https://doi.org/10.3390/ijms25073727.

24. Pereira A. S., Souza A., Fraga J. L., Villeneuve P., Torres A. G., Amaral P. F. F. Lipases as Effective Green Biocatalysts for Phytosterol.Esters’ Production: A Review // Catalysts 2022, 12, 88–112. https://doi.org/10.3390/catal12010088.

25. Giorgi V., Botto E., Fontana C., Mea L. D., Vaz S., Jr., Menéndez P., Rodríguez P. Enzymatic Production of Lauroyl and Stearoyl Monoesters of D-Xylose, L-Arabinose, and D-Glucose as Potential Lignocellulosic-Derived Products, and Their Evaluation as Antimicrobial Agents //Catalysts 2022. V.12. P. 610–675. https://doi.org/10.3390/catal12060610.

26. Мамарасулова З.В., Громова В.В. Синтетические моторные и авиационные масла: Современное состояние и тенденции развития // Химическая промышленность. 2006. Т. 83, № 5, с. 251–258.

27. Тонконогов Б.П., Попова К.А., Хурумова. А.Ф. Перспективы применения сложных эфиров отечественного производства в качестве основ масел для авиационной техники // Химическая Технология Топлива и Высокоэнергетических Веществ. 2015. Т. 278. № 1. С. 109–120.

28. Нартова А.В., Ананьина А.А., Семиколенов С.В., Перминова Л.В., Беклемишев А.Б., Ларичев Ю.В., Саланов А.Н., Коваленко Г.А. Активация углеродных материалов марки Сибунит оксидом азота (II): исследование физико-химических и адсорбционных свойств азотсодержащих носителей. Испытания полученных адсорбентов для приготовления биокатализаторов низкотемпературного синтеза сложных эфиров // Катализ в промышленности. 2025. В печати.

29. Патент 2 668 405 RU C1, опубл. 08.06.2018.

30. Патент 2 725 474 RU C1, опубл. 02.07.2020.

31. Коваленко Г.А., Перминова Л.В. Гетерогенные биокаталитические процессы низкотемпературного синтеза сложных эфиров: выбор органического растворителя // Катал. промышл. 2020. Т. 20. № 4. С. 313–322. DOI: 10.1134/S2070050421010074).

32. Kovalenko G., Perminova L., Beklemishev A. Heterogeneous biocatalytical esterificarion of recombinant Thermomyces lanuginosus lipase immobilized on microporous carbon aerogel // Catalysis Today. 2021. V.379. P. 36–41. https://doi.org/10.1016/j.cattod.2020.11.018.

33. Коваленко Г.А., Перминова Л.В., Шашков М.В., Беклемишев А.Б. Биокаталитические гетерогенные процессы низкотемпературного синтеза моноэфиров диолов // Кинет. Катал. 2022. V. 63. № 2. С. 212–222. DOI: 10.31857/S0453881122020046.

34. Коваленко Г.А., Перминова Л.В., Беклемишев А.Б., Пыхтина М.Б., Холявка М.Г., Бучельникова В.А., Артюхов В.Г. Модуляция каталитических свойств иммобилизованной рекомбинантной липазы из Thermomyces lanuginosus в реакции этерификации путем выбора адсорбента // Прикладная биохимия и микробиология. 2022. Т. 58. № 5. С. 446–458. Doi: 10.31857/s0555109922050099.